DNA labeling的問題

我想問一下有關DNA labeling的問題, 我們實驗室有買一組Kit, Pierce的biotin 3\' end DNA labeling kit, 它是利用TdT酵素將帶有biotin的核苷酸黏到3\'端上, 它kit原本的成分是biotin-N4-CTP, 可是最近它把成分改為biotin-11-UTP而無事先告知, 結果我相關實驗就做不出來了! 事後才發現它成份改了, 我想問的是: 要label DNA不是應該用DNA的單元嗎? 如: dCTP, dUTP等, 為何可以用CTP或UTP呢? 若可以的話, 它們差在哪裡呢?

我事後去單買了biotin-N4-CTP (好貴, 要1萬多塊), 結果一樣實驗做不出來, 不知是否和我問的問題有相關...感謝各位解答

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恩,我問過教授了,他也不清楚...而酵素等其他東西都是換新的,所以應該不是東西壞掉...目前懷疑nucleotide有錯...但還是希望高手解答一下...謝啦!

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真是抱歉,大家好像誤會我的意思了, 一開始沒說清楚, kit本身並沒有問題,我的DNA也確實有label成功, 且可偵測, 但是用新的kit所label之DNA在我之後的實驗應用中做出來結果與以前完全相反,所以我的問題是擺在, 就像小賢子提到的, 您是用biotin-11-"dUTP"當作label物質來label DNA, 而這我這套kit是用biotin-11-"UTP" (少了個d, 即2'端保有-OH), 我想知道差在這裡對日後的實驗是否會有影響性?還是兩者完全沒差?謝謝各位熱心幫忙...

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另外小賢子同學質疑的我已經皆考慮進去了,我用的水是二次水,而且是滅菌過的,還加上有過0.22um之濾網,所以理應不會有DNase,單股DNA的量也是經過計算的,一定足夠

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嗯,因為我的實驗需求所致,我不能在我的probe上標定biotin,因為我是測protein與DNA binding之能力,若DNA上有標定biotin,會干擾我的實驗結果,所以我只能標在尾端,我只是問看看:有人會拿UTP(而非dUTP)來標定DNA嗎?因為UTP不是應該標在RNA上才比較合理嗎?用RNA單元來標定DNA是乎不太合邏輯…若有人這樣做的話,他的意義是什麼呢?

3 個解答

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  • 1 0 年前
    最佳解答

    我剛剛上網看了一下你那套KIT的操作方法,發現他是針對你所設計的單股核酸片段進行Biotin標定,操作雖然簡便,但也如果1.你要標定的單股DNA使用的量不夠,或是2.你使用的水裡面所含有的一些核酸水解酵素,把你的單股DNA吃掉,那你的實驗就危險了,...所以他建議使用"ultrapure"的去離子水,這也是這套KIT在使用過程中比較可能有的問題.其中他所用的biotin-11-UTP是沒有問題的.

    在我以往做核酸標定的經驗中,我們比較常用在DNA上標定biotin的為Roche賣的,主要是利用我們已經有的雙股DNA片段,經過加熱使其形成單股DNA後,利用帶有biotin標定的隨機引子及biotin-11-dUTP以Klenow fragment DNA polymerase,將我們提供的DNA片段,進行biotin的標定,即為你要的探針(probe).之後,您即可利用此一探針繼續進行您的實驗了!

    2006-06-10 22:29:45 補充:

    您提到的問題,就是他使用biotin-11-UTP與biotin-11-dUTP的差異,剛剛我看了一下他的操作說明,應該對你的結果不會有影響,因為他用的酵素與一般標定時所用的酵素不同,他只會標定在你提供DNA的3'端,對你所提供的DNA並沒有影響,你也說明了利用這種方式可以標定與偵測.只是它使用這樣的酵素系統,真的會有比較好的偵測效果嗎?理論上,他標定的biotin量比較少耶!

    2006-06-12 08:50:22 補充:

    對你最後所說,一般在我們製備探針的實驗中,不會用biotin-11-UTP來代替biotin-11-dUTP,因為這樣感覺上是沒有什麼意義的。但針對你要做DNA與蛋白質之間的相互關係的話,如果使用biotin-11-UTP的話,相對的比較不會有干擾的發生,或許還有其他的因素,可能就要請教其他有做過這方面實驗的高手了~

    參考資料: http://www.piercenet.com,/ 自己的操作經驗
  • 1 0 年前

    個人覺得是酵素的問題耶。你要不要換新的酵素試試看。

    2006-06-08 23:23:27 補充:

    什麼是nucleotide有錯?不懂

  • 1 0 年前

    其實問教授比較快哦 ~~ 真的

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