小佑.... 發問時間: 科學其他:科學 · 1 0 年前

關於生物科技一些問題

請問western blot和PCR步驟和說明

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  • 1 0 年前
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    西方墨點法Western Blot

    使用時機:確認試驗

    檢體種類:生化管(PBI tube)

    檢驗時間:酵素免疫分析法陽性時

    靈敏度sensitivity:100%, 但有空窗期6-12週

    特異性specificity:100%

    Western Blot原理

    先做HIV培養;分離病毒之後,加以溶解。

    以polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) 依分子量大小不同而加以分離。

    轉印(transblot)至膜(nitrocellulose)上,切成條狀後用於臨床上,診斷待測檢體之抗體。

    待測血清中若有HIV Ab,則會接strip上的HIV Ag,經由conjugate作用(goat anti-human IgG with alkaline phostatase),最後由substrate( BCIP /NBT)呈色判讀。

    西方墨點法應用

    1) 母子間之垂直感染

    2) 輸血或輸注血液製劑後之追蹤

    3) 危險行為後或醫護人員被針刺後之追蹤

    4) HIV 感染各臨床時期之追蹤

    SARS實驗室診斷方法之使用(衛生署疾病管制局)  

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    檢驗結果判讀之建議

    SARS檢驗陽性

    a) SARS病毒PCR確認陽性

    - 至少2種不同的臨床檢體(例如鼻咽檢體及糞便);或

    - 同一種臨床檢體,但是在病程中不同的二天或多日所採取(例如二次或二次以上的鼻咽吸出液);或

    - 使用原始臨床檢體,分別操作二種不同的試驗,或分別重複操作PCR

    b) 以酵素免疫分析法(ELISA)或免疫螢光分析法(IFA)檢驗血清抗體陽轉(seroconversion)

    - 急性期血清抗體檢測陰性,恢復期血清抗體檢測陽性

    - 同時檢測急性期及恢復期血清抗體,效價呈四倍以上上升

    c) 病毒分離

    - 自任何檢體以細胞培養分離SARS冠狀病毒,並以經認可的PCR方法確認

    PCR陽性之確認

    - PCR的操作流程中,每一批檢體應包含適當的陰性及陽性對照,並產生預期的結果:

    s 操作萃取核酸流程時加入一個陰性對照,另於操作PCR時加入一個水樣對照

    s 操作萃取核酸流程及PCR時各加入一個陽性對照

    s 抑制性對照(inhibition control)- 病人檢體加入弱陽性對照組以偵測抑制PCR之物質

    - 若得到陽性PCR結果,應以下列方法確認:

    s 使用原始檢體再重做一次; 或

    s 同一個檢體在第二個實驗室再做一次

    若能放大另一個基因區域將增加試驗的特異性

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