? 發問時間: 科學化學 · 1 0 年前

HPLC詳細操作步驟

請問HPLC的詳細操作步驟,希望可以詳細點,尤其是細節的部份,

例如:UV偵測器是設好波長後馬上按歸零,還是設好後等要注射樣品時再歸零即可?若我是使用UV偵測器開啟它後,要注意面板上的什麼,如何操作UV的面板呢?詳細一點,謝謝!

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  • 1 0 年前
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    壹、用途說明

    高效液相層析技術(High Performance Liquid Chromatography, HPLC)為分析技術中應用最廣泛的一種層析法。

    層析分離過程,主要由不同物質,在兩個不相容的媒介(亦即固定相及移動相)之間的平衡分佈差異而定。欲分離的成份需先溶於溶劑中,然後在高壓下注入分離管柱,樣品中的各個成份藉由移動相的帶動,滲透通過分離管柱中的固定相。各成份的移度依其平衡分佈狀態而定,有些成份和固定相之間的作用力不大,很快地被沖堤出分離管柱,而有些成份與固定相作用力較快,則較慢沖堤出來。

    由於各成份與固定相的作用不同,造成移動速度的差異,因此產生分離效果。由於不同特性的移動相及分離管柱的配合,HPLC可有多種分離模式,因此可廣泛的應用於不同型態的化合物分析,其領域可適用於化學、化工、醫藥檢驗、農化、環境檢驗、生化、食品飲料等各類樣品分析及作為學術研究與開發產品研究之應用工具。

    貳、使用規則

    一、高效液態層析儀(A)機,除需具操作 HPLC 基本能力外,並需看過"HPLC控制分析系統 Millennium32"影片者,方具使用資格。89/07/26

    二、除請先辦理預約手續,每一實驗室預約每次以不超過48小時為原則(請參閱預約規定),使用時並在使用登記簿上登記。

    三、詳閱使用規則:

    1.樣品須經過淨化處理,一般用0.2 µm過濾膜過濾,以去除顆粒或雜質。

    2.(1)以水及緩衝液當溶劑時,一般用0.2 µm過濾膜過濾,且pH值一定要在2~8之間。

    (2)使用有機溶劑時,須用LC級或E. Merck廠牌GR級以上的品質,若有機溶劑含有顆粒或雜質時,仍須以0.2 µm過濾膜過濾。

    3.層析柱之選擇,依使用溶劑之極性而定,原則上是使用溶劑之極性在相當於氯仿(CHCl3)極性以下時,使用normal phase之層析柱,如:µ-porasil使用相當於甲醇(CH3OH)極性以上之溶劑時,用reverse phase之層析柱,如:C18。溶劑之極性,請參用Solvent Use Index。

    4.操作時之壓力,最好小於2,000psi,以保護層析柱的壽命。

    5.需更換層析柱時,先要視察管道中之溶劑的種類,若與欲使用之溶劑不互溶時(如:正己烷與甲醇),則將原來的層析柱拆下,用可互溶溶劑約40ml沖洗,再以欲使用之溶劑約40ml沖洗,然後再裝上欲使用之層析柱。

    6.裝層析柱有一定方向,須依照層析柱上箭頭的指示裝上,若方向裝相反,則其壽命很快消失。

    7.換裝層析柱時,以不漏為原則,接頭不必扭太緊,以避免螺紋磨損。

    8.調整溶劑流速時,一次不可太快,1 ml流速之改變,一般須等2分鐘以上。

    9.注射樣品之注射針筒(Syringe)使用後請立即用溶劑清洗以防堵塞。

    10.使用後,依照保存層析柱之建議方法及資料,用適當的溶劑保存。如 -porasil保存於正己烷,C18保存於甲醇,蛋白質層析柱則保存在0.05% Sodium azide溶液中 (若溶劑為緩衝溶液時,須先用純水約100 ml清洗,然後再用適當溶劑保存)。

    11.將層析柱所含之溶劑,記錄在登記簿上,以讓下一位使用者知道。

    12.將儀器電源關掉,檯面清除乾淨,將廢液倒入廢液瓶中。

    13.務使儀器回復原狀,帶走所有私人帶來的藥品、溶劑及廢液,保持房間清潔。

    14.HPLC操作結束後,請務必做好系統平衡工作,尤其是移動相為buffer者。

    15.平衡方式如下:

    (1)Buffer使用者,請以水Run 60分鐘 ,再換成Methanol Run 20分鐘。

    (2)有機Solvent使用者, 請以Methanol Run 30分鐘。

    參、操作步驟

    一、打開儀器電源開關。

    二、將白色Teflon溶劑導管放入欲使用的溶劑瓶內,務必使導管上的過濾子沈入瓶底,並將瓶口用鋁箔紙蓋好。

    三、用10ml針筒插入pump溶劑抽出口,並將Valve向左扭鬆(約3~5圈),再用10ml針筒抽出溶劑導管內的空氣,並抽出溶煤約5~8ml(注意:如一次無法完成時,可將針筒拔出,排出空氣,再重行抽取),打開pump的流速至1.0ml/min,將剛才針筒抽出之5~8ml溶劑,用手加壓打入pump,直至溶劑從出口處流出(操作作此步驟時C閥須在垂直位置,A-B閥則在"INJ"位置)。

    四、打開偵測器並待機器校正完成後即可輸入波長(波長為190nm~600nm)。

    五、樣品注入法:

    1.將Injector上面A-B閥之扳手從"INJ"位置向右轉至Load位置。

    2.將Injector下面C閥之扳手向下轉至垂直位置,並將Loading plug向外拔出。

    3.將樣品用微量注射針筒抽取後,插入Loading port,並慢慢地注入。

    4.將Injector Loading plug插回原來位置,並將C閥扳手向左上方旋緊。

    5.將Injector上面A-B閥扳手從"Load"向左轉至"INJ"位置,此時樣品始進 入層析柱。

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