Todd 發問時間: 科學工程學 · 1 0 年前

請問只用PCR產物可作real time PCR的絕對定量嗎

請問只用PCR產物可作real time PCR的絕對定量嗎? 謝謝!

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先謝謝Chu您的回覆,不過應該是我的問法有誤,更正如下:

1.我是環工,作環境微生物的,想利用real-time PCR偵測環境中某種細菌的數量,因此在抽完DNA後,要以QPCR分析時,則定量的檢量線該如何製作??我有看過相對定量與絕對定量,但論文寫得很模糊,所以想請教大大,我該如何進行? 或是否提供不錯的參考資料,我是第一次接觸real-time PCR的新手啦! 謝謝。

ps:有PCR的經驗

1 個解答

評分
  • Chu
    Lv 4
    1 0 年前
    最佳解答

    請問你是要對PCR產物進行定量嗎?

    也就是...已經跑過PCR的短鏈目標DNA要再進行定量?

    原則上只要是針對同一個範圍去做,或者是更小的範圍去做,應該都是可以吧,只是,如果是要知道PCR 產物的濃度,直接測吸光值求DNA濃度不是更快?

    還有 如果你是混合樣品,PCR產物再進行PCR的過程中,可能會發生生物種多者越多,少者越少的可能,而失去原本的意義,你要多考慮一下,若只是要定出原本DNA濃度,應該就沒有這個疑慮...

    2007-01-14 02:02:11 補充:

    其實我也是環工的,也是做環境微生物。

    目前我對定量方式的了解,大概有三種,其中兩種是絕對定量。

    最常見的,應就是利用clone的方式,將目標DNA利用clone後,同時取得質體與利用平板技術法定量,因此質體DNA中目標DNA濃度等於平板技術法之菌數濃度,單位cfu/ml,由對已知濃度質體DNA做稀釋系列後,跑Real-Time PCR,便可求得檢量線。

    2007-01-14 02:04:33 補充:

    另一種絕對定量方法更簡單,只要將萃取後的DNA利用測吸光值可換算出DNA重量濃度,單位ng/ml,接著便可將已知濃度DNA以稀釋系列跑Real-Time PCR,求得檢量線。

    2007-01-14 02:07:51 補充:

    上面兩種定量方法是我目前也有在用的,我目前測都還滿準的,你可以試試看。

    至於相對定量的部分,則必須先找到一段所有微生物都存在的DNA,如house keeping gene,以此為基準,去比較基準DNA與目標DNA濃度的差,便可求得目標DNA佔總DNA濃度的比例,單位為%。

    這些是我目前看到大部分paper提到的方法,希望對你有所幫助。

    參考資料: Real-Time PCR 操作經驗
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