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匿名使用者 發問時間: 科學生物學 · 1 0 年前

Real-time PCR的絕對定量

請簡述一下原理(螢光標訂的機制.機器如何偵測螢光)

我不要問data怎麼看因為我會了

我只要問絕對定量有關螢光的部分

1 個解答

評分
  • 陳皓
    Lv 6
    1 0 年前
    最佳解答

    Real-time PCR 或稱Quantitative PCR (Q-PCR)

    是一種藉著PCR操作協助定量DNA or RNA (進行RT-PCR) 濃度的方法。

    [注意]:千萬不可將Real-time PCR 簡稱為RT-PCR。

    其原理是操作PCR的同時,再加入一段螢光標記的探針 (可與DNA樣品互補),

    重點是當這段探針與DNA樣品互補時,才會發散出螢光,

    所以隨著PCR的循環次數愈多,DNA濃度愈高,偵測到的螢光強度就愈高。

    因此儀器內部會設定一個預期達到的螢光強度,達到該螢光強度所需要的cycle 次數

    (稱threshold cycle) 便與樣品原本DNA濃度成反比。

    亦即DNA樣品濃度愈多,可以較少的 threshold cycle便達到預測的螢光強度;

    DNA樣品濃度愈少,便需較多的threshold cycle才達到預測的螢光強度。

    因此便能畫出各已知核酸濃度與threshold cycle間反比的檢量線。未知樣品便能從檢量線中求得。

    以下是列舉兩種廠商設計的原理:

    1. Hydrolysis probe (TaqMan system)

    操作PCR時,加入的探針是Dual-labeled probe (雙重標記的探針),亦即:

    在probe的5'端標記欲測的螢光分子(Fluorophore為reporter dye);

    在probe的3'端標記Quencher dye,此Quencher dye 與螢光分子靠近時,

    由於FRET (Fluorescence resonance energy transfer) 效應,

    會吸收螢光分子的能量,而無法釋出螢光,

    唯有隨著PCR進行時,Taq polymerase 之5'→3' exonuclease活性

    將probe的螢光分子切出才測到螢光。

    圖片參考:http://www.e-biolearning.com/bbs/attachments/photo...

    2. Molecular Beacon

    此方法是利用具有二級結構的probe,在其兩端亦分別標記Fluorophore及Quencher,

    因此probe於二級構形下由於 FRET 效應,無法發散出螢光。

    隨著PCR複製時,加熱使淂probe的二級結構瓦解,而與DNA樣品互補,

    此時Fluorophore不受Qucncher的抑制而發出螢光。

    圖片參考:http://www.e-biolearning.com/bbs/attachments/photo...

    圖片參考:http://www.e-biolearning.com/bbs/attachments/photo...

    Dr. 陳皓

    參考資料: www.e-biolearning.com (E-流生化教育網版權所有)
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