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匿名使用者 發問時間: 科學化學 · 1 0 年前

如何測試RNA與cDNA品質~20 point~

請教各位前輩~

各位在萃取完RNA後,除了用分光光度計與電泳進行判定品質外還有其他方法嗎??

同樣的確定RNA品質後合cDNA,之後品質測定我們都會用house keeping gene進行PCR判定品質,是否有其他方法可以判定?

那如果有DNA殘留是不是用基因組的DNA與cDNA PCR後的結果進行比較才能知道是否有DNA污染?

附上~我是學植物的!^^~感謝你看完我的問題~

已更新項目:

謝謝gene的回答~^^~

你指出的primer設計~在剛開始搜尋相似序列作比對時,只要是cDNA的序列所做出來的 primer是不是就可以避開掉intron..

PCR的電泳結果出來後 ,如果與預期的大小片段相似 ,就可以進行之後的動作了對吧!?

其實我再做實驗上是沒這些問題...只是我們家的老闆!懷疑這個那個的...讓我也開始覺得怪怪的....因為過去做沒問題~怎麼到我做時...老闆開始問東問西..呵

2 個已更新項目:

謝謝gene大 ~

目前我實驗的sample已送定序~

預期大小與設計primer時相符....希望結果與我想要的相同!^^

3 個已更新項目:

結果相當不錯...符合預期!!^^~

經NCBI blast後~有擴增到我要的基因~

3 個解答

評分
  • gene
    Lv 5
    1 0 年前
    最佳解答

    一般實驗室最常用的方法就測OD值和RNA 電泳了

    還有我知道一種新發展出來的方法... 2100 Bioanalyzer

    這裡有介紹http://www.chem.agilent.com/Scripts/PDS.asp?lPage=...

    不過很少實驗室買的起,而且只是要看RNA純度...有點大材小用了.

    要看RNA和cDNA品質,測吸光值和RNA 電泳就很夠了

    而用housekeeping gene除了做為PCR的操作時是否正確的依據

    還有一個很重要的功能,

    就是用來比較各基因表現量的基準線...

    至於要避免RNA殘留的DNA去干擾RT-PCR或其他分析的進行...

    通常在RNA抽好之後,再RT-PCR前

    我會先用DNase處理過,去除殘留的DNA

    RT-PCR後再用RNase去除RNA...

    有時sample太少時...就可以不做這幾個步驟..

    把重點放在primer設計上

    在設計primer時

    將primer設計在跨過兩個exon之間,中間有一個intron的位置

    因為由RNA 來的cDNA是沒有intron的

    這樣就能避開殘留DNA的干擾...只有cDNA才會有PCR產物

    這樣不知有沒有回答你的問題....

    還有問題我再補充

    2007-07-30 11:14:13 補充:

    從NCBI其他Database搜尋到的sequence如果他有註明是CDS(complete sequence),mRNA或cDNA,

    這樣的sequence是不含intron的沒錯,

    不過mRNA是由很多個exon所組成

    例如:exon1,exon2,exon3,exon4,exon5,......

    2007-07-30 11:14:33 補充:

    我說的將primer設計在exon之間...就是

    forward primer設計在exon1,exon2之間,橫跨了這兩個exon...

    reverse primer設計在exon4,exon5之間,橫跨了這兩個exon...

    如果template是來自genome,因為含有intron所以primer無法配對上去...

    所以不會有產物

    如果template是cDNA primer才會配對上去....

    2007-07-30 11:16:00 補充:

    我想妳們老師的疑慮可能是如果你的primer在一個exon之中,

    沒有跨intron...這樣既使PCR產物大小相近...

    但很難確認是不是不專一的PCR產物...

    除非將PCR產物送去定序....或是用Restriction enzyme切...

    希望對你有幫助...

    參考資料: 我的小腦袋
  • 1 0 年前

    因為他是以EXON的序列來設計primer,他有強調要跨越過2ㄍEXON,因為exon跟exon之間有intron,所以他有一定的專一性!!!

  • 1 0 年前

    能夠請問一下,為何如果template是來自genome,因為含有intron所以primer無法配對上去...所以不會有產物,如果template是cDNA primer才會配對上去呢??才疏學淺,敬請見諒~~~

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