無法顯示 發問時間: 科學其他:科學 · 1 0 年前

求RT-PCR原理圖片等等

RT-PCR的原理跟圖片 圖解 之類的 越詳細越好..

5 個解答

評分
  • 1 0 年前
    最佳解答

    主要是介紹即時聚合鏈反應(real-time PCR)的實驗原理和新技術,比利時Gent大學的博士後研究員Jo Vandesompele來演講:即時聚合鏈反應的正規化(Normalization of real-time RT-PCR)。

    雖然我把題目翻譯成中文,相信大家應該還是沒有概念的:我還是先簡單介紹聚合鏈反應(PCR, polymerase chain reaction)吧!聚合酵素(polymerase)是負責DNA合成的酵素,在1955年發現,一開始生物學家的想法很簡單,就是模仿生物體內的反應,把模板DNA(template)和引信(primer)加上合成DNA的原料(dNTP,核甘三磷酸)以及聚合酵素放在一起,應該就可以在一個試管內產生DNA合成的反應,這樣的方式比藉由細菌增殖質體(plasmid)內所夾帶的特定基因還要快速簡單得多,隨後1977年在溫泉中發現的Thermus Aquaticus細菌中所含有的聚合酵素(俗稱Taq polymerase),因為具有耐高溫的特性,所以能夠勝任PCR的循環(cycle)主要三步驟:變性(denaturation)、引信附著(annealing)、聚合化(polymeration),要以少數的模板合成大量的DNA需要20至30個循環,一開始的酵素是由大腸桿菌分離的Klenow片段(fragment of Klenow),並不耐高溫,直至Taq聚合酵素被發現後才真正造成PCR實驗的重大突破。

    那麼RT-PCR又是什麼東東呢?RT指的是逆轉錄酶(reverse transcriptase),也就是把RNA轉錄成DNA的酵素,因為一般生物原則(dogma)是DNA轉錄成RNA,再由RNA轉譯成蛋白質,所以由RNA變成DNA便被視為一種逆向轉換,才加上reverse,RNA病毒(例如愛滋病)就是靠著合成這樣的酵素才得以將RNA轉變成DNA。RT-PCR的定義就是將目標細胞內的RNA逆轉錄為DNA,再進行聚合酶反應,這是一種分析細胞內RNA表現的方法之一,因為分解RNA的酵素(RNase)無處不在,只要溫度一升高,RNA就非常容易被分解,科學家們只好先將它轉變為互補DNA(cDNA),再進行聚合酶反應。

    至於即時RT-PCR(real time RT-PCR)則是利用非常敏感的螢光染劑(例如Sybr Green),當試管內形成雙股DNA時,這個螢光染劑就會與之結合並且大放光芒,機器在每一個循環都紀錄釋出的螢光指數,由於聚合連鎖反應會造成DNA成對數性的增加(每個循環就增加2倍,那30個循環就會增加2的30次方倍),螢光指數也會隨著DNA的複製(形成雙股)而增加,科學家發現一件很有趣的事,螢光指數突然開始快速增長的某個循環(這個加速的起點是由一個叫做threshold的值來定義),這個循環則稱為Ct(cycle of threshold)的值與起初cDNA的含量成反比(當然,只限於同一次PCR反應中的比較性定量),也因為這個發現,所以我們能夠用推測當初的RNA含量,進而研究細胞內基因表現的變化。這又要說到PCR是非常不精確的一種反應,我們拿等量的DNA來進行同一個PCR,30個循環之後,所得到的band(我們把反應後的產物拿去跑電泳,溴乙烷ethyl bromide染色後用放射顯影autoradiography後呈現的條狀影像)很有可能會有不一樣的粗細程度,所以嚴格來說PCR是不能用來定量的,然而即時聚合鏈反應則由於使用了敏感的螢光劑,所以突破了這個限制,在嚴格的控管情形下,是可以定量細胞內基因的表現程度的。

    現在我們了解了題目的後半段,那該來談談正規化的意義了,

    一般生物學實驗常常使用管家基因(housekeeping gene)來當作對照組,這些基因廣泛存在各種生物細胞體內,科學家們假設他們的含量並不會因為各種實驗條件而有太大的變化,所以當我們要比較兩個實驗條件下某個基因表現的變化時,就需要用管家基因的表現當作基準,再來比較目標基因的變化,其實也有其他方法,例如以細胞數來當標準,但是,到目前為止細胞數的定量,也還停留在非常不準確的情況,所以用管家基因為準的假設仍是最常見的方式。

    Jo的看法,就是他認為以單一管家基因為準的方式是不合理的,因為實驗結果很有可能受到管家基因表現變化的影響,他認為應該綜合至少三個(但不超過六個)管家基因的表現為評判標準,至於他所採用的方法..

    這邊有個網址"http://tw.search.yahoo.com/language/translatedPage...

    你可以去看看~

    參考資料: 知識.
  • 6 年前

    到下面的網址看看吧

    ▶▶http://*****

  • 1 0 年前

    其實這是網友票選結果

    並不是發問者自選啦

    不過晴天娃娃的回答真的很好

    我對於結果也很困惑

  • 1 0 年前

    其他回答這個寫的比最佳解答好!結果上面那個拿到最佳解答,看來你是在趕作業吧!

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  • 1 0 年前

    PCR的技術是在數億個DNA成份中,測定出是否存在著一段基因

    PCR的基本原理

    聚合酶連鎖反應(Polymerase chain reaction,PCR)是一套發展完善且簡便有效的核酸增幅方法,它可使DNA在短暫的時間中增幅。其原理主要為在要增幅的DNA片段兩端分別設計一個前置引子(forward primer)和反置引子(reverseprimer),使之與已變性的單股目標DNA緩冷配對(annealing)後,再利用DNA聚合酶(DNApolymerase)以目標DNA的兩股分別做為模板(template)來合成新的DNA片段。

    PCR操作過程主要分成三大部份:

    (1)以高溫(90C-95C)使雙股模板DNA分離稱為"denaturation"

    (2)primer引子在40~60℃與單股DNA結合稱為"annealing"

    (3)由DANpolymerase酵素來合成DNA的一段稱為"extension"。將溫度調整到DNA聚合酶作用的有效溫度而合成新的DNA股(70C-75C)。

    藉由循環式的溫度升降操作下,每一次熱循環可使DNA的量加倍,若重複操作多次,以數學公式計算,DNA增加的量將會是2n,n是代表重複操作的次數。

    圖片參考:http://1.blog.xuite.net/1/2/9/9/13777309/blog_1559...

    PCR的優點:快速,敏感度高,特異性好。

    RT-PCR

    某些RNA病毒,可以使用Reverse transcriptase,RT 和polymerase的工作在同一緩衝液中進行或分次進行稱為RT-PCR,例如HIV,HCV的診斷。有的公司如Roche,Amplicor的試藥,就使用單一酵素rTthDNA polymerase具有反轉錄及放大的能力。

    而反轉錄聚合酶連鎖反應(reverse transcrip-tion-PCR,RT-PCR),是聚合酶鏈式反應的一種廣泛應用的變形。在RT-PCR中,一條RNA鏈被反轉錄成為互補式DNA(cDNA),再以此為模板進行PCR反應使DNA擴增。其中,由一條RNA單鏈轉錄為互補式DNA稱作「反轉錄」,並由依賴RNA的DNA反轉錄酶來完成。隨後,DNA的另一條鏈通過去氧核苷酸引子和依賴DNA的DNA聚合酶完成,隨每個循環倍增,即通常的PCR。RT-PCR的指數擴增是一種很靈敏的技術,可以檢測很低濃度的RNA。

    圖片參考:http://1.blog.xuite.net/1/2/9/9/13777309/blog_1559...

    Real-time PCR 或稱Quantitative PCR (Q-PCR)

    是一種藉著PCR操作協助定量DNA or RNA (進行RT-PCR) 濃度的方法。

    [注意]:千萬不可將Real-time PCR 簡稱為RT-PCR。

    其原理是操作PCR的同時,再加入一段螢光標記的探針 (可與DNA樣品互補),重點是當這段探針與DNA樣品互補時,才會發散出螢光,

    所以隨著PCR的循環次數愈多,DNA濃度愈高,偵測到的螢光強度就愈高。因此儀器內部會設定一個預期達到的螢光強度,達到該螢光強度所需要的cycle 次數 (稱threshold cycle) 便與樣品原本DNA濃度成反比。

    圖片參考:http://e-biolearning.com/bbs/attachments/photo_070...

    亦即DNA樣品濃度愈多,可以較少的 threshold cycle便達到預測的螢光強度;DNA樣品濃度愈少,便需較多的thresholdcycle才達到預測的螢光強度。因此便能畫出各已知核酸濃度與threshold cycle間反比的檢量線。未知樣品便能從檢量線中求得。

    以下是列舉兩種廠商設計的原理:

    1. Hydrolysis probe (TaqMan system)

    操作PCR時,加入的探針是Dual-labeled probe (雙重標記的探針),亦即在probe的5'端標記欲測的螢光分子(Fluorophore為reporter dye);在probe的3'端標記Quencher dye,此Quencher dye 與螢光分子靠近時,由於FRET (Fluorescence resonance energy transfer) 效應,會吸收螢光分子的能量,而無法釋出螢光,唯有隨著PCR進行時,Taq polymerase 之5'→3' exonuclease活性將probe的螢光分子切出才測到螢光。

    圖片參考:http://e-biolearning.com/bbs/attachments/photo_070...

    2. Molecular Beacon

    此方法是利用具有二級結構的probe,在其兩端亦分別標記Fluorophore及Quencher,因此probe於二級構形下由於 FRET 效應,無法發散出螢光。

    圖片參考:http://e-biolearning.com/bbs/attachments/photo_070...

    隨著PCR複製時,加熱使淂probe的二級結構瓦解,而與DNA樣品互補,此時Fluorophore不受Qucncher的抑制而發出螢光。

    圖片參考:http://e-biolearning.com/bbs/attachments/photo_070...

    參考資料是貼我的BLOG啦!^^"因為REFERANCE在那裡面

    另外上一個回答的該不會是http://blog.sina.com.tw/1776/article.php?pbgid=177...

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