只要糖果 發問時間: 科學化學 · 1 0 年前

np/ rp/ IS HPLC的差異跟判別結構的方法?

請問np HPLC 跟 Rp HPLC及 ion-suppresion HPLC的差異在哪?適合的用途又有何不同?

又 為何利用不同的buffer system所得出的結果可以判定分子的結構?

我知道HPLC跟LC的原理是類似的 都是用極性去分開compond

但如果只是因為加減一些官能基會使極性改變 又從何確定這些增減極性程度相似的官能基一定是相同的東西?

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我是看到有一些用isotope去標定sample後再跑HPLC的paper

裡面是有用上commercial的reference compond 去跟 sample "cochromatograph"

data裡看起來sample跑出來的fraction跟reference是在一樣的位置

所以作者會去推測這是一樣的東西

不過用不同的buffer system不是也有可能跑出不同的fraction pattern嗎?

這樣用1.2個system去跑完 看起來一樣 就下結論 好像有點不嚴謹...

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這些paper是在測某些compond被昆蟲攝食以後在體內的代謝途徑

幾乎都是用HPLC去分析代謝產物後

就下結論說在此compond的某處被加以修飾(OH基變成acyl ester.phoaphate.acetate之類的修飾)

當然大部分都有用H3之類的isotope去標定 之後可能跑個scintilation去看含量

不過的確沒有用上mass或NMR來分析結構....

所以我才會產生對他們如何僅僅用HPLC就定出結構的疑問...

3 個已更新項目:

所以說即使加入isotope標定後去跑HPLC

在沒有輔以NMR.MASS等這些解結構的方法之下

是沒辦法確切知道sample在代謝過程中到底變成何種產物囉?

有幾篇paper裡

是有用到特定的酵素再去切用HPL分出來的apolar compond

然後再跑一次HPLC

再下結論說是何處被修飾成某種官能基

這樣的說法可以認為是合理的嗎?

還是跟上面說的一樣

只能認為是依據經驗法則判斷特定酵素的反應位置而得到的間接證據?

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第2次跑HPLC是把這個compound 跟refference一起跑

然後分出幾個跟refference一樣的fraction

他們就認為這個compond是由refference的這幾種物質conjugate而來的

然後這個conjugation是在某某OH group 上被acylation or phosphorylation... etc.

5 個已更新項目:

至於添加isotope的部份

我只確定這樣可以用scitillator去count他的代謝率/轉換的efficiency等等

而對判定結構部份到底有沒有影響 我就看不出來了...

畢竟你說的那幾種方法(NMR/ MASS/ infar red這些)在這幾篇papaer裡都沒有用上...

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不好意思 越問越多^^"

我自己是作生理的 對化學這方面懂得實在有限

只好在這邊問專家了

這邊的點數是一定要給你的XD

只是選完最佳解答就不能再加補充內容了

要是這樣就沒辦法討論了@@"

所以請讓我問個透徹再結案吧XD

7 個已更新項目:

isotope我覺得在這邊應該主要是用於定量

被標定的已知compond讓昆蟲攝食進去

經過代謝成別的未知compound

這中間的轉換efficiency跟代謝產物的量

都是把從HPLC分出來的fraction用scintillation去測isotope的量來決定的

並不是直接在LC上裝置測量isotope的偵測器

所以我想那個應該是不能拿來當判別結構的依據才對

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關鍵應該就是你說跟referrence一起跑的那個部份

但是為什麼第一次LC的一個fraction

分出來跟reference跑第2次LC

假如跑出來2個分別符合2種reference的peak

為什麼作者能說這個compound是這2種reference物質的conjugation?

又為何可以斷言是在哪個位置上進行conjugation及esterfy/phosphorylation?

如果只依照我敘述的這些步驟跟方法

沒辦法得到直接證據證明作者得出的結果

而是只是跟reference有相同的peak這樣的間接證據

那可能真的就是這類研究的結論下的不夠嚴謹了

9 個已更新項目:

他們好像都只有sample 去過 scintillator定量,

所以倒是沒有訊息重疊的問題

至於跑LC的refference

雖然paper裡都只是輕描淡寫說哪裡是reference跑出來的fraction

我想很可能是跟sample在相同condition下分開跑吧

不然的確是會有分不出來源是誰的這種問題

1 個解答

評分
  • 1 0 年前
    最佳解答

    1. normal phase 跟 reverse phase的差異是在動相與靜相的極性大小關係. normal phase中, 靜相極性比動相大.

    至於ion-suppresion, 通常使用在離子交換層析(Ion-exchange Chromatography, IC)上, 通常使用電導度偵測器測量離子. 但動相溶液中的離子(例如緩衝溶液)也會讓偵測器產生訊號. 所以在電導度計之前加上離子抑制器將動相中的離子還原成分子的型態.

    2. 沒聽說可以這樣解結構, 可否舉例? 通常用來解結構的工具, 是質譜儀或者NMR. 當然你可以用其他儀器做些篩選, 例如光譜方法可以判定是否含有特定官能基, 讓解結構的工作更順利, 但是要"解"結構, 光靠LC是行不通的

    2007-11-13 02:18:41 補充:

    層析方法是利用各分析物的物理或化學性質的差異而進行分離的方法. 兩種化合物分不開只是說這次挑選的方法(包含動靜兩相), 無法將化合物分開, 簡單的說, 不是方法不合適, 就是這組化合物的某項性質差異不夠大. 所以分不開就說是同一種化合物這種說法可能是不夠嚴謹. 就算說用了一兩百種不同的buffer system分不開就判定說是相同化合物似乎也不是很能讓人接受(當然, 機率上應該已經很好了)

    2007-11-13 02:18:49 補充:

    不過你題到的這些做法, 看起來不一定是解結構. 他們可能已經知道某個器官或組織含有一些特定的酶, 特定的化合物就會有特定的反應, 就像你說某處加上一個OH一樣. 這種情形的話, 就變成只是多些證據支持這些反應, 雖然對結構上的證據不是很直接, 但還是有其價值.

    2007-11-14 10:33:36 補充:

    這種添加同位素取代物的方法, 我看起來只是添加的化合物跟你們的目標化合物的LC peak 疊在一起沒分開, 光這樣就說是同一種化合物我個人無法接受. 至少要提出說明為什麼添加這個化合物, 這個化合物就是這個代謝的產物嗎? 如果說這個代謝產物已知, 那當然可以就添加這個化合物當作一個簡單的驗證. 這一定都是間接性的證據, 直接的證據只有MASS, NMR(印象中有三樣, 可是想不起來)

    另外, 有的檢測方法是可以觀測官能基, (例如 IR). 這時你就可以觀測, 本來沒有這個官能基, 代謝後有, 這也是另一種很好用的證據.

    2007-11-14 10:35:44 補充:

    最後這段比較奇怪, 照你寫的, 先跑一次LC, 得到一個化合物. 然後把這個化合物用酵素去切成幾段後再跑一次LC. 那第二次跑LC只能看出這個化合物到底被切成幾段啊, 你是不是還沒寫完?

    2007-11-14 23:40:02 補充:

    那應該沒錯, 這個reference應該已經被研究透徹到爛了, 而研究的課題又是一個特定的化合物, 也算是已知的東西, 所以他們就說這疊在一起的peak就是一樣的東西.

    至於添加isotope reference, 我不知道這是比較早加入, 讓酵素一起切, 還是在跑LC之前才加入, 只在LC上比對. 但不管是哪一種, 都需要分別知道ref與目標化合物的訊號大小. 問題是這是怎麼測的? 在一般LC用的偵測器上無法分辨是否有加入同位素. 我知道有專門偵測含放射線物質的偵測器, 就算是reference有放射性, 但這個就無法測量一般的化合物, paper上有沒有說這怎麼做的?

    2007-11-16 03:37:32 補充:

    以解結構而言, 並沒有決定性的證據, 所以是不夠嚴謹, 不過我覺得處理生物方面的問題時, 好像有許多的經驗可以套用, 例如之前說的, 他可能已經知道這個反應的產物, 現在只是要一個證據支持而已. 或者說這個酵素一定會在分子的某一個取代基上反應而不是另一個. 如果這些說法成立的話, 就不需要真的把結構解出來.

    2007-11-16 03:49:02 補充:

    在這方面很現實的是成本問題, 如果每個問題都要用這麼高的規格去處理的話人力財力物力時間可能都難以負擔. 所以各領域可能都有一些既定的經驗可以去忽略一些問題. 我曾經去看過學校化工所研究觸媒的實驗室, 他們研究處理氣體的觸媒, 所以要用GC去分析機器出口的氣體. 問題是那些處理數據的概念我根本無法接受, 可是他們領域, paper都是這樣出的

    2007-11-16 03:52:24 補充:

    在你說的實驗中, 同位素是用來定量的, 這一點毫無疑問. 我比較好奇的地方是, sample跟reference(含同位素)兩種化合物既然從LC出來時並沒有分開, 那怎麼分別定量? 如果說用scintillation測同位素, 可是如果是同一種化合物, 應該會產生波長相當接近的光, 那並沒有辦法個別定量啊

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