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匿名使用者 發問時間: 科學生物學 · 1 0 年前

請問做RT時denature是必要的嗎?

請問做RT(revers transcript)時denature是必要的嗎?

做denature是為了把mRNA拉直以及讓primer anneal上去是嗎?

那如果primer已經anneal上,直接就做RT會有什麼樣的影響嗎?

還是其實影響不大呢? 感謝回答!!

已更新項目:

非常感謝回答!!

所以二級結構在RT的反應溫度(42~50℃)是能被解開的嗎?

另外如果不使用加熱的方式,還有其他方式能將mRNA拉直嗎?

或者直接做RT也是可行的?(假設primer已經接在mRNA上)

感謝!!

3 個解答

評分
  • gene
    Lv 5
    1 0 年前
    最佳解答

    Reverse Transcription 和PCR是不一樣的...

    Reverse Transcription 的目的是將mRNA轉換為cDNA...

    在做Reverse Transcription 時,

    是沒有升溫將primer從template上denature,

    或是降溫讓primer anneal上mRNA的步驟...

    因為Reverse Transcriptase不是能夠耐高溫的酵素...

    大概65 ℃ 至70 ℃ ,就會讓逆轉錄酶失去活性...

    逆轉錄酶的作用溫度是42 ℃至50℃...

    這樣的溫度下,大多的二級結構會被解開...

    而且Reverse Transcription所使用的primer通常是poly-(T) primer,

    或是random primer(hexmer primer或是nonamer primer)...

    因為真核生物的mRNA的3'端會被加上 poly-A tail...

    所以在做Reverse Transcription 時,

    可以用poly-(T) primer和poly-A tail binding,作為primer,合成cDNA...

    random primer則是幾個隨機的單股核甘酸作為primer...

    如Hexmer primer就是由6個隨機的核甘酸組成的primer...

    random primer是隨機的和mRNA binding...

    合成cDNA...

    一般實驗室中的作法...

    1.如果你的mRNA是從冰箱拿出來解凍的...

    可能會有2級結構...

    所以你可以先取需要的RNA,加上primer,dNTP,

    並加nuclease-free H2O ...加到一定體積後...

    2.先在65℃至80℃ incubation 5分鐘,消除二級結構

    注意這時候是還沒加逆轉錄酶喔

    3.5分鐘後迅速放回冰上,並加入逆轉錄酶和buffer...

    4.在42℃中反應1至2小時,反應中溫度是不變的...

    不同廠牌的逆轉錄酶反應溫度可能不同...

    5.反應時間到了以後,升溫至75℃,目的是使逆轉錄酶失去活性...

    6.反應結束了,這時候可以再用RNase處理,去除原來的mRNA

    這時tube中的產物是cDNA...保存在4℃,-20℃或-80℃..依個人需要而定 ...

    如果是Reverse Transcription PCR,

    也是需要先經過以上Reverse Transcription 的步驟...

    然後取cDNA做PCR...

    這時候就像一般PCR,要有denature和anneal的升溫和降溫了...

    如果大大需要Reverse Transcription PCR的解說...

    再補充吧

    希望對你有幫助

    2007-11-13 14:03:34 補充:

    45℃至50℃的溫度...

    一般hybridize較少(只有短片段的配對)的二級結構是可以被解開的...

    當然很長很長的就不能被分開...

    但是不用擔心primer不能和template 配對...

    因為Reverse Transcription 用的primer...

    通常是poly-(T) primer,或是random primer(hexmer primer或是nonamer primer)...

    這種primer是很短的...不需太高的溫度就能分開...

    前面有說到在做RT前先升溫至65至80℃

    是因為如果RNA是從冷凍狀態退冰的sample才需要...

    不過如果沒有這個步驟也不至於做不出來

    2007-11-13 14:08:38 補充:

    有很多方式可以將二及結構的RNA拉直...

    除了溫度,還有改變溶液中鹽類濃度,改變pH值...

    不過改變溶液中鹽類濃度,改變pH值...

    都會影響之後的酵素作用效率...

    每一種酵素都有適合的作用環境...

    所以改變鹽類濃度和改變pH值...都會影響之後的反應進行

    改變溫度是最簡單而且不會影響後續處理的方式

    2007-11-13 14:20:28 補充:

    建議你...

    如果已經加了primer,可以直接做...

    擔心二級結構的話,可以incubation 在65℃ ,3-5分鐘...

    然後"趕快"做 Reverse Transcription ...

    因為RNA很不穩定...很容易degradation...

    趕快翻成cDNA會比較穩定...

    通常我們在抽完mRNA後,都馬上做RT...

    翻成cDNA後才作保存...

    參考資料: 我的小腦袋
  • 7 年前

    到下面的網址看看吧

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  • ?
    Lv 6
    1 0 年前

    的確是必要的

    因為你不確定是否mRNA有形成二級或三級的結構

    剛好在primer binding sites的話

    再怎麼批都批不出來的

    如果DNA primers已經黏上去了

    你還是可以進行denaturaon的步驟

    讓DNA primers掉下來

    再進行annealing跟elongation

    總之PCR都是循環的反應

    從哪個狀態放入

    它就會從哪裡作用開始

    如果覺得primer黏上後進行RT-PCR會有影響

    那就是將它denature摟~

    以上提供給你參考摟~

    有問題再提出來問吧!!

    2007-11-12 14:31:26 補充:

    更正 denaturation

    打字太快 電腦跟不上啊?

    硬是跳過兩個字母

    參考資料: 生科系學生, 爛電腦
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