請問做RT時denature是必要的嗎？
請問做RT(revers transcript)時denature是必要的嗎？
做denature是為了把mRNA拉直以及讓primer anneal上去是嗎？
那如果primer已經anneal上，直接就做RT會有什麼樣的影響嗎？
還是其實影響不大呢？ 感謝回答！！
非常感謝回答！！
所以二級結構在RT的反應溫度(42~50℃)是能被解開的嗎？
另外如果不使用加熱的方式，還有其他方式能將mRNA拉直嗎？
或者直接做RT也是可行的？(假設primer已經接在mRNA上)
感謝！！
3 個解答
- geneLv 51 0 年前最佳解答
Reverse Transcription 和PCR是不一樣的...
Reverse Transcription 的目的是將mRNA轉換為cDNA...
在做Reverse Transcription 時,
是沒有升溫將primer從template上denature,
或是降溫讓primer anneal上mRNA的步驟...
因為Reverse Transcriptase不是能夠耐高溫的酵素...
大概65 ℃ 至70 ℃ ,就會讓逆轉錄酶失去活性...
逆轉錄酶的作用溫度是42 ℃至50℃...
這樣的溫度下,大多的二級結構會被解開...
而且Reverse Transcription所使用的primer通常是poly-(T) primer,
或是random primer(hexmer primer或是nonamer primer)...
因為真核生物的mRNA的3'端會被加上 poly-A tail...
所以在做Reverse Transcription 時,
可以用poly-(T) primer和poly-A tail binding,作為primer,合成cDNA...
random primer則是幾個隨機的單股核甘酸作為primer...
如Hexmer primer就是由6個隨機的核甘酸組成的primer...
random primer是隨機的和mRNA binding...
合成cDNA...
一般實驗室中的作法...
1.如果你的mRNA是從冰箱拿出來解凍的...
可能會有2級結構...
所以你可以先取需要的RNA,加上primer,dNTP,
並加nuclease-free H2O ...加到一定體積後...
2.先在65℃至80℃ incubation 5分鐘,消除二級結構
注意這時候是還沒加逆轉錄酶喔
3.5分鐘後迅速放回冰上,並加入逆轉錄酶和buffer...
4.在42℃中反應1至2小時,反應中溫度是不變的...
不同廠牌的逆轉錄酶反應溫度可能不同...
5.反應時間到了以後,升溫至75℃,目的是使逆轉錄酶失去活性...
6.反應結束了,這時候可以再用RNase處理,去除原來的mRNA
這時tube中的產物是cDNA...保存在4℃,-20℃或-80℃..依個人需要而定 ...
如果是Reverse Transcription PCR,
也是需要先經過以上Reverse Transcription 的步驟...
然後取cDNA做PCR...
這時候就像一般PCR,要有denature和anneal的升溫和降溫了...
如果大大需要Reverse Transcription PCR的解說...
再補充吧
希望對你有幫助
2007-11-13 14:03:34 補充：
45℃至50℃的溫度...
一般hybridize較少(只有短片段的配對)的二級結構是可以被解開的...
當然很長很長的就不能被分開...
但是不用擔心primer不能和template 配對...
因為Reverse Transcription 用的primer...
通常是poly-(T) primer,或是random primer(hexmer primer或是nonamer primer)...
這種primer是很短的...不需太高的溫度就能分開...
前面有說到在做RT前先升溫至65至80℃
是因為如果RNA是從冷凍狀態退冰的sample才需要...
不過如果沒有這個步驟也不至於做不出來
2007-11-13 14:08:38 補充：
有很多方式可以將二及結構的RNA拉直...
除了溫度,還有改變溶液中鹽類濃度,改變pH值...
不過改變溶液中鹽類濃度,改變pH值...
都會影響之後的酵素作用效率...
每一種酵素都有適合的作用環境...
所以改變鹽類濃度和改變pH值...都會影響之後的反應進行
改變溫度是最簡單而且不會影響後續處理的方式
2007-11-13 14:20:28 補充：
建議你...
如果已經加了primer,可以直接做...
擔心二級結構的話,可以incubation 在65℃ ,3-5分鐘...
然後"趕快"做 Reverse Transcription ...
因為RNA很不穩定...很容易degradation...
趕快翻成cDNA會比較穩定...
通常我們在抽完mRNA後,都馬上做RT...
翻成cDNA後才作保存...
參考資料： 我的小腦袋 - ?Lv 61 0 年前
的確是必要的
因為你不確定是否mRNA有形成二級或三級的結構
剛好在primer binding sites的話
再怎麼批都批不出來的
如果DNA primers已經黏上去了
你還是可以進行denaturaon的步驟
讓DNA primers掉下來
再進行annealing跟elongation
總之PCR都是循環的反應
從哪個狀態放入
它就會從哪裡作用開始
如果覺得primer黏上後進行RT-PCR會有影響
那就是將它denature摟~
以上提供給你參考摟~
有問題再提出來問吧!!
2007-11-12 14:31:26 補充：
更正 denaturation
打字太快 電腦跟不上啊?
硬是跳過兩個字母
參考資料： 生科系學生, 爛電腦
