小雨 發問時間: 科學生物學 · 1 0 年前

restriction enzyme常用的濃度是多少unit

1. 通常20ul時加1ul的restriction enzyme

但我發現我的vector常常無法切完全

而必須gel elution

且我的enzyme濃度是4000U/ml

比起其他enZ動輒10000~20000U/ml

需要增加使用量嗎

有沒有paper或可靠來源可參考

另外vector run gel後看不太清楚

2. 要怎樣看的較清楚才能切膠

是要增加EtBr的量還是loadind多一點

每well最多可load多少呢(一片膠有六孔的大小)

2 個解答

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  • 最佳解答

    其實最佳的參考資料就是提供 restriction enzyme的原廠目錄或者網站上的資料。

    在restriction enzyme 一定會描述 unit definition

    以 New England Biolab 的 HindIII 為例

    Unit Definition:

    One unit is defined as the amount of enzyme required to digest 1 µg of λ DNA in 1 hour at 37°C in a total reaction volume of 50 µl.

    而就算濃度是4000U/ml 每 1 µl,也有 4unit,足夠切 4 µg的 DNA了,所以你要估計你下的 plasmid DNA 有多少,可以與 marker 相對照,用軟體或肉眼估計。

    再來是 20ul 的反應加 1ul 的 restriction enzyme 太多了,小心 star activity。建議放大體積或者減少 restriction enzyme。

    至於看不清楚,是連 marker 都看不清楚嗎?還有 marker loading 了多少才看不清楚?如果 marker 看的清楚,而樣品看不清楚,那就是樣品濃度應該在提高一點,或者多 loading 一些。如果 loading量足夠,但是連marker都看不清楚,那就需要增加 EtBr的量。或者利用外染的方式補足 EtBr的量。

  • 1 0 年前

    你需要知道 vector的量才能決定要加多少酵素

    此外反應體積有時候也是決定反應效果的因素

    看不清楚~有可能是因為切不完全量太少~

    有時候是因為DNA太多了所以很拖~

    有時候可以增加膠的濃度來解決~

    一片膠六孔~我通常會把他封成兩孔~

    一次 load 50ul不成問題~

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