~TIFFANY~ 發問時間: 科學生物學 · 10 年前

如何使用NCBI用primer去查cDNA

如何使用NCBI用primer去查cDNA

我現在想用vector NTI去做一個map(pEGFP-N2/rat TGN38)

vector-pEGFP-N2;insert- TGN38

那我要如何去找出cDNA呢

data sheet有給我RT用的primer from RNA of NRK cell

也有給一段PCR from cDNA 的primer

請幫我詳解喔 謝謝!!!

已更新項目:

我的資料上有給我 RT primer和PCR上合成cDNA的primer

我不懂為什麼要找CDNA耶

2 個已更新項目:

RT with primer(~)from total RNA of NRK cell

PCR from cDNA

(F) ggaattcatgcagttcctggttgcgtt

(R)cgggatcccaagctttaggttcaaacgttggta

可是夾不出來耶

2 個解答

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    Lv 7
    10 年前
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    NCBI的primer設計功能

    http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/

    也可以反向用primer來找基因

    把已知primer放到Primer Parameters去搜尋

    不會操作的話,按下頁面各處的問號符號就有說明

    用NCBI的搜尋列找 pEGFP-N2與 rattus TGN38

    pEGFP-N2 (U57608.1)

    http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/U57608.1

    rattus TGN38 (X53565.1)

    http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/X53565.1

    右邊的Pick Primers的選項就可以設計primerFind in this sequence找序列對應位置

    或是切換上面的Graphics選項,用圖形介面去對位置或標記

    2011-09-19 13:07:55 補充:

    您是要找PCR產物的序列嗎?

    從NCBI database的資列比對出primer位置後,primer加上中間所夾的,就是產物cDNA序列。

    2011-09-19 15:23:22 補充:

    把primer對TGN38作BLASTN,會發現這對primer是對rattus TGN38 (X53565.1)的cds用的

    看X53565.1的Graphics,有一段紅線標示CAA37637.1。這是TGN38轉譯為蛋白質的序列(cds, Coding sequence)。

    Forward primer 可以分成兩部分 ggaattc ATGCAGTTCCTGGTTGCGTT

    ggaattc是EcoR1的限制酶序列,ATG.......GTT部分就是CAA37637.1的前20個序列

    2011-09-19 15:27:10 補充:

    Reverse primer 也是兩部分cgggatcccAAGCTTTAGGTTCAAACGTTGGTA

    cgggatccc是BamH1的限制酶序列,AAG.....GTA部分就是對應CAA37637.1的1059-1082位置的24個序列。

    2011-09-19 15:36:34 補充:

    操作方式:

    開啟NCBI X53565.1,右邊點選Run BLAST,勾選Align two or more sequences。

    在Enter Subject Sequence欄位輸入primer序列(FASTA格式,如果不會用,就一次只比對一條,不要加入序列以外的文字)

    Program Selection選Somewhat similar sequences (blastn)。

    然後按下BLAST鍵

    2011-09-19 15:36:50 補充:

    >lcl|56058 FP

    Length=27

    Score = 37.4 bits (40), Expect = 3e-07

    Identities = 20/20 (100%), Gaps = 0/20 (0%)

    Strand=Plus/Plus

    Query 12 ATGCAGTTCCTGGTTGCGTT 31

    ||||||||||||||||||||

    Sbjct 8 ATGCAGTTCCTGGTTGCGTT 27

    >lcl|56059 RP

    Length=33

    Score = 44.6 bits (48), Expect = 2e-0

    2011-09-19 15:37:26 補充:

    Score = 44.6 bits (48), Expect = 2e-09

    Identities = 24/24 (100%), Gaps = 0/24 (0%)

    Strand=Plus/Minus

    Query 1059 TACCAACGTTTGAACCTAAAGCTT 1082

    ||||||||||||||||||||||||

    Sbjct 33 TACCAACGTTTGAACCTAAAGCTT 10

    2011-09-19 15:44:57 補充:

    更正: AAG.....GTA部分就是對應X53565.1的1059-1082位置的24個序列。

    對CAA37637.1來說是1048-1071的位置

    2011-09-19 15:49:48 補充:

    您的cDNA產物就是X53565.1的12-1082,5'-端加ggaattc-,3'-端加-gggatcccg。

    5' ggaattc-X53565.1(12-1082)-gggatcccg 3'

    2011-09-19 16:00:44 補充:

    然後以EcoR1, BamH1將cDNA clone到peGFP-N2。clone的位置可參考peGFP-N2的圖譜

    http://www.addgene.org/22735/

    或者您自己已經有vector NTI可用

    2011-09-19 16:05:09 補充:

    直接用pimer-BLAST找不到,是因為序列中包含了不屬於primer的限制酶接點序列。

  • 4 年前

    Ncbi Pick Primers

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